2022年1月7日，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所余佳教授團(tuán)隊(duì)在Science Advances發(fā)表了論文“Single-cell architecture and functional requirement of alternative splicing during hematopoietic stem cell formation”。該研究首次在單細(xì)胞水平系統(tǒng)性描繪了小鼠造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell, HSC）發(fā)育全程的RNA剪接圖譜，并對(duì)內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化（endothelial-hematopoietic transition, EHT）過程的關(guān)鍵可變剪接（alternative splicing, AS）事件及其上游調(diào)控因素進(jìn)行探究，鑒定出Srsf2通過調(diào)控造血細(xì)胞特異性AS事件促進(jìn)HSC發(fā)生的新機(jī)制。
近年來，迫切的臨床需求加之體外再生效率低下，使得HSC的高效獲取成為最受關(guān)注的研究領(lǐng)域之一。HSC發(fā)育是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的動(dòng)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，關(guān)于其胚胎起源的時(shí)序特征、發(fā)生機(jī)制等仍存在諸多未知。精確解析HSC發(fā)生的調(diào)控規(guī)律，是指導(dǎo)體外功能性HSC再生的先決條件?；趩渭?xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，余佳研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了基于轉(zhuǎn)錄本層面的基因表達(dá)圖譜，鑒定出一系列生血內(nèi)皮細(xì)胞（hemogenic endothelial cell,HEC）、T1 pre-HSC階段特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本。值得注意的是，某些基因僅僅呈現(xiàn)某個(gè)特殊轉(zhuǎn)錄本的造血階段特異性表達(dá)，而這種表達(dá)差異在基因?qū)用嬗捎谄渌D(zhuǎn)錄本干擾被掩蓋（圖1），提示目前轉(zhuǎn)錄組研究以“基因”為中心的分析模式存在不足，而將同一基因的不同轉(zhuǎn)錄本納入分析范疇，將為深入理解和剖析基因功能提供更多參考和依據(jù)。
圖1. HSC發(fā)育全程的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本圖譜
在上述發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上，本研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步從AS角度解析T1 pre-HSC所呈現(xiàn)的最為顯著的轉(zhuǎn)錄本多樣性。在整個(gè)EHT過程中，共鑒定出超過一萬(wàn)多個(gè)AS事件，并且AS事件的發(fā)生頻率在T1 pre-HSC階段達(dá)到峰值，與其顯著的轉(zhuǎn)錄本多樣性吻合。借助單細(xì)胞測(cè)序的優(yōu)勢(shì)，研究團(tuán)隊(duì)在隨后分析中引入“modality”的概念，即：根據(jù)AS事件在同一細(xì)胞群體內(nèi)的分布情況將其分為5種模式。本研究有趣地發(fā)現(xiàn)，伴隨細(xì)胞命運(yùn)從內(nèi)皮向造血的逐步轉(zhuǎn)換，“included”類型的AS事件也呈現(xiàn)分階段產(chǎn)生的特征，包括分別鑒定出的979個(gè)HEC階段開始出現(xiàn)的“included”AS事件，以及822個(gè)T1 pre-HSC階段開始出現(xiàn)“included”AS事件。由于上述AS事件均特異性發(fā)生在具備造血潛能的細(xì)胞群體中，故將其統(tǒng)稱為造血細(xì)胞特異性“included”AS事件，而這些事件很可能為HSC產(chǎn)生所必需（圖2）。
圖2. EHT過程中造血細(xì)胞特異性“included”AS事件的鑒定
為了探究調(diào)控這些AS事件的上游因素，研究團(tuán)隊(duì)通過對(duì)其旁側(cè)序列的RNA motif分析，預(yù)測(cè)出若干剪接因子結(jié)合位點(diǎn)，并結(jié)合候選剪接因子在EHT過程的表達(dá)變化，選定Srsf2為后續(xù)研究對(duì)象。研究團(tuán)隊(duì)隨后構(gòu)建了條件下敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞Srsf2缺失導(dǎo)致主動(dòng)脈內(nèi)造血簇?cái)?shù)量的顯著減少，HEC比例也顯著降低。繼而，通過AGM區(qū)的組織塊培養(yǎng)及后續(xù)移植發(fā)現(xiàn)，Srsf2突變胚胎的嵌合率顯著降低，同時(shí)伴隨髓系、B細(xì)胞和T細(xì)胞的重建缺陷。最后，對(duì)Srsf2缺失的HEC群體進(jìn)行少量細(xì)胞RNA-seq分析，結(jié)果顯示，Srsf2缺失造成HEC細(xì)胞AS譜的整體改變，其中不乏調(diào)控HSC發(fā)生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，如：Runx1和Myb等。因此，Srsf2可以通過改變EHT過程中關(guān)鍵基因的剪接模式，在HSC發(fā)生中發(fā)揮不可或缺的作用。
該研究拓展了人類對(duì)于HSC發(fā)育過程轉(zhuǎn)錄組認(rèn)識(shí)的深度和廣度，并從RNA可變剪接角度重新審視EHT過程，證明可變剪接可通過改變基因特定轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)的重要作用。
本研究工作得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（項(xiàng)目編號(hào)：2021-I2M-1-019和2021-I2M-1-040）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2019YFA0801800,2019YFA0111700,2017YFA0103401,2016YFA0100601, 2020YFA0112402）等項(xiàng)目的資助。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所余佳教授、暨南大學(xué)蘭雨研究員、解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心劉兵研究員、南方醫(yī)科大學(xué)王棟教授為本文的共同通訊作者。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所王芳教授、任悅博士，南方醫(yī)科大學(xué)譚普文博士，軍事醫(yī)學(xué)研究院張鵬程博士為本文的共同第一作者。
論文鏈接:
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abg5369
基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所
